Häufige Anwendungen
Optophotometer ist eine sehr wichtige Klasse von Analyseinrichtungen, ob in der Physik, Chemie, Biologie, Medizin, Materialwissenschaft, Umweltwissenschaften und anderen wissenschaftlichen Forschungsbereichen oder in der Chemie, Medizin, Umweltprüfung, Metallurgie und anderen modernen Produktions- und Managementbereichen, UV-sichtbare Spektrophotometrie hat eine breite und wichtige Anwendung. Ein Spektrophotometer ist ein Instrument zur quantitativen und qualitativen Analyse von Substanzen mit Spektrophotometrie, das häufig für die Quantifizierung von Nukleinsäuren, Proteinen und Bakterienwachstumskonzentrationen verwendet wird.
Ultramikrospektrophotometer sind zum konventionellen Instrument in modernen Molekularbiologielabors geworden. Häufig verwendet für die Quantifizierung von Nukleinsäuren, Proteinen und Bakterienwachstumskonzentrationen.
Quantifizierung der Nukleensäure
Die Quantifizierung von Nukleensäuren ist eine Funktion, die mit einer hohen Frequenz von Ultramikrospektrophotometern verwendet wird. Oligonukleotide, einkettige, doppelkettige DNA und RNA können in Puffern quantifiziert werden. Hohe Absorptionsspitzen von Nukleensäuren haben eine Absorptionswellenlänge von 260nm. Die molekulare Zusammensetzung jeder Nukleensäure ist unterschiedlich, so dass ihre Umwandlungskoeffizienten unterschiedlich sind. Quantifizieren Sie verschiedene Arten von Nukleinsäuren und wählen Sie im Voraus den entsprechenden Koeffizienten aus. Beispielsweise entspricht der Absorptionswert von 1OD 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA und 30 μg / ml Olig. Der getestete Absorptionswert wird durch den oben genannten Koeffizienten umgerechnet, um die entsprechende Probenkonzentration zu ermitteln. Wählen Sie vor dem Test das richtige Verfahren aus, geben Sie das Volumen der Roh- und Verdünnungsflüssigkeit ein und testen Sie anschließend die Leerflüssigkeit und die Probenflüssigkeit. Das Experiment war jedoch nicht reibungslos. Unstabile Lesungen können ein Problem mit Kopfschmerzen bei den Experimentierenden sein. Je empfindlicher das Instrument ist, desto größer ist der Absorptionswert.
Tatsächlich erlaubt das Konstruktionsprinzip und das Arbeitsprinzip des Spektrophotometers, dass die Absorptionswerte innerhalb eines bestimmten Bereichs variieren, d. h. das Instrument hat eine gewisse Genauigkeit und Genauigkeit. Die Genauigkeit des deutschen Berg Colibri Ultramikrospektrofotometers beträgt ≤1,0% (1A). Es ist normal, dass die Ergebnisse mehrerer Tests zwischen etwa 1,0% des Durchschnittswertes variieren. Darüber hinaus müssen die materialisierenden Eigenschaften der Nukleinsäure selbst und der pH-Wert des gelösten Nukleinsäurepuffers, der Ionenkonzentration usw. berücksichtigt werden: Bei der Prüfung ist die Ionenkonzentration zu hoch und führt auch zu einer Messung-Drift, daher wird empfohlen, einen bestimmten pH-Wert zu verwenden, einen niedrigeren Ionenkonzentrationspuffer wie TE, der die Messung stark stabilisieren kann. Die Verdünnungskonzentration der Probe ist ebenfalls ein nicht zu vernachlässigender Faktor: Da in der Probe unvermeidlich einige kleine Partikel vorhanden sind, insbesondere Nukleinsäureproben. Die Anwesenheit dieser kleinen Partikel stört den Testeffekt. Um den Einfluss der Partikel auf die Testergebnisse stark zu reduzieren, ist der Nukleinsäureabsorptionswert mindestens größer als 0,1A erforderlich und der Absorptionswert liegt bei 0,1-1,5A. In diesem Bereich ist die Störung der Partikel relativ gering und das Ergebnis stabil. Dies bedeutet, dass die Konzentration der Probe nicht zu niedrig oder zu hoch sein darf (über den Testbereich des Fotometers hinaus). Betriebsfaktoren, wie Mischung ausreichend, sonst ist der Absorptionswert zu niedrig und sogar negativ; Die Mischung kann keine Blasen vorhanden sein, die leere Flüssigkeit hat keine Suspension, sonst drift die Messung stark; Die leere Flüssigkeit und die Probe müssen mit der gleichen farbigen Tasse getestet werden, sonst ist der Konzentrationsunterschied zu groß; Konvertierungskoeffizienten und konsistente Auswahl der Probenkonzentrationseinheiten; Nicht mit Fensterverschleiß gefärbte Becher; Das Volumen der Probe muss mehrere Bedienungsangelegenheiten wie das kleine Volumen des Farbbechers erfordern.
Neben der Nukleinsäurekonzentration zeigt das Spektrophotometer gleichzeitig mehrere sehr wichtige Verhältnisse, die die Reinheit der Probe anzeigen, wie das Verhältnis A260/A280, das zur Bewertung der Reinheit der Probe verwendet wird, da der Absorptionsspitze des Proteins 280 nm beträgt. Bei reinen Proben ist das Verhältnis größer als 1,8 (DNA) oder 2,0 (RNA). Wenn das Verhältnis unter 1,8 oder 2,0 liegt, ist es eine Wirkung von Proteinen oder Phenolen. A230 bedeutet, dass einige Schadstoffe wie Kohlenhydrate, Polypeptide* usw. in der Probe vorhanden sind, wobei das Verhältnis der reineren Nukleinsäure A260/A230 größer als 2,0 ist. A320 erkennt die Trübung und andere Störungen der Lösung. Reine Proben, A320 ist in der Regel 0.
Direkte Proteinmassage
Diese Methode testet das Protein direkt in einer Wellenlänge von 280 nm. Wenn Sie die Warburg-Formel wählen, kann das Photometer die Konzentration der Probe direkt anzeigen oder die entsprechende Konvertierungsmethode wählen, um den Absorptionswert in die Probenkonzentration umzuwandeln. Der Proteinmessungsprozess ist sehr einfach: Zuerst wird die leere Flüssigkeit getestet und dann direkt das Protein getestet. Da einige Verunreinigungen im Puffer vorhanden sind, müssen Sie in der Regel 320 nm "Hintergrund" -Informationen beseitigen und diese Funktion "On" einstellen. Ähnlich wie die Nukleinsäure, die getestet wird, erfordert A280 einen Absorptionswert von mindestens 0,1A mit einem linearen Bereich zwischen 1,0 und 1,5. Bei der Auswahl der Warburg-Formel für die Anzeige der Probenkonzentration im Experiment wurde festgestellt, dass die Messungen "driften". Das ist ein normales Phänomen. Tatsächlich zeigt die Beobachtung eines Veränderungsbereichs der Absorptionswerte von A280 nicht mehr als 1%, dass die Ergebnisse sehr stabil sind. Der Grund für die Drift ist, dass die Warburg-Formel die Absorptionswerte in die Konzentration umwandelt, multipliziert mit einem bestimmten Koeffizienten, solange sich die Absorptionswerte etwas ändern, wird die Konzentration vergrößert, so dass das Ergebnis sehr instabil ist. Die direkte Protein-Quantifizierungsmethode eignet sich für die Prüfung reinerer, relativ einheitlicher Proteine. UV-Direkt-Quantifizierung im Vergleich zu Farbvergleich, schnelle Geschwindigkeit und einfache Bedienung; Anfällig für Störungen durch parallele Substanzen wie DNA; Auch eine geringe Empfindlichkeit erfordert eine höhere Proteinkonzentration.
Chromatometrische Proteinquantifikation
Eiweiße sind in der Regel Verbindungen aus mehreren Proteinen, die auf der Grundlage der chromatographischen Bestimmung basieren: Aminosäuren (z. B. *, *) reagieren mit zusätzlichen farbigen Gruppen oder Farbstoffen, um farbige Substanzen zu erzeugen. Die Konzentration der farbigen Substanz ist direkt mit der Anzahl der Aminosäuren in der Proteinreaktion verbunden, die die Proteinkonzentration reagieren.
In der Regel gibt es mehrere Methoden wie BCA, Bradford, Lowry und andere.
Lowry-Methode: basiert auf frühen Biuret-Reaktionen und wurde verbessert. Das Protein reagiert mit Cu2 und bildet einen blauen Reaktor. Die Lowry-Methode ist jedoch empfindlicher als Biuret. Der Nachteil ist, dass mehrere verschiedene Reaktionsmittel in der Reihenfolge hinzugefügt werden müssen; längere Reaktionszeit; Anfällig für nicht-proteinische Substanzen; Proteine, die Stoffe wie EDTA, Tritonx-100, Ammoniasulfat enthalten, sind für diese Methode nicht geeignet.
BCA (Bicinchoninineacidassay): Dies ist eine neuere, empfindlichere Methode des Proteintests. Das zu analysierende Protein reagiert mit Cu2 in einer alkalischen Lösung, um Cu zu erzeugen, das mit BCA Chelat bildet, um violette Verbindungen zu bilden, die Spitzen bei 562 nm Wellenlänge absorbieren. Die lineare Beziehung zwischen dieser Verbindung und der Proteinkonzentration* ist sehr stabil. Im Vergleich zur Lowry-Methode ist die Bedienung einfach und empfindlich. Aber ähnlich wie die Lowry-Methode ist es anfällig für Störungen zwischen den Proteinen und Entreinigungsmitteln.
Bradford-Methode: Das Prinzip dieser Methode besteht darin, dass das Protein mit Cobalt-Leukanen bindet und einen Absorptionsspitze von 595 nm für farbige Verbindungen erzeugt. Die Eigenschaft ist, dass die Empfindlichkeit gut ist, die doppelt so hoch ist wie die beiden Testmethoden Lowry und BCA; Einfacher und schneller zu bedienen; Sie benötigen nur ein Reaktionsmittel; Verbindungen können für eine Stunde stabilisiert werden, um das Ergebnis zu erleichtern; Und kompatibel mit einer Reihe von Reduktionsmitteln, die Lowry-BCA-Reaktionen stören (wie DTT, Merctylethanol). Allerdings ist es immer noch empfindlich gegenüber den Entfernungsmitteln. Der Hauptnachteil ist, dass unterschiedliche Standards zu größeren Unterschieden in den Ergebnissen der gleichen Probe führen können, die unvergleichlich sind.
Einige Forscher, die zum ersten Mal mit der Chromatometrie konfrontiert wurden, könnten sich für die Ergebnisse verschiedener Chromatometrien nicht einhergehen und sich verwirren, welcher Methode genau zu glauben? Da die Reaktionsgruppen und die Farbgruppen unterschiedlich sind, ist die Verwendung mehrerer Methoden gleichzeitig unvergleichlich für die gewonnenen Probenkonzentrationen in derselben Probe. Beispielsweise testeten Keller et al. das Protein in der menschlichen Milch und Lowry ergab, dass die BCA-Konzentrationen deutlich höher als Bradford waren und sich erheblich unterschieden. Selbst bei der Messung derselben Probe ist die Standardprobe, die in derselben Farbmethode ausgewählt wurde, nicht konsistent und die Konzentration nach dem Test ist nicht konsistent. Zum Beispiel Lowry-Test des Proteins in Zellhomogramm, mit BSA als Standard, Konzentration 1,34 mg / ml, mit a-Globulin als Standard, Konzentration 2,64 mg / ml. Daher suchen Sie vor der Auswahl eines Farbvergleichs nach Standardproteinen mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung als Standardprodukt, die sich auf die chemische Zusammensetzung der zu testenden Probe beziehen. Darüber hinaus ist das häufig auftretende Problem bei der Quantifizierung von Proteinen durch Chromatographie, dass der Absorptionswert der Probe zu niedrig ist, was zu einer größeren Differenz zwischen der gemessenen Probenkonzentration und der tatsächlichen Konzentration führt. Das Schlüsselproblem ist, dass das wichtige Zubehör des 1011-Spektrophotometers nach der Reaktion eine bestimmte Halbwertszeit hat, so dass jedes Spektrophotometer die Reaktionstestzeiten auflistet und alle Proben (einschließlich Standardproben) innerhalb dieser Zeit getestet werden müssen. Die Zeit ist zu lang, der erhaltene Absorptionswert wird kleiner und der konvertierte Konzentrationswert sinkt. Darüber hinaus sind die Reaktionstemperatur, der pH-Wert der Lösung usw. wichtige Gründe für den Einfluss auf das Experiment. Darüber hinaus ist sehr wichtig, dass die Farbvergleich von Plastik verwendet wird. Vermeiden Sie die Verwendung von Vergleichsbecheln aus Quartz oder Glas, da die Farbe nach der Reaktion Quartz oder Glas färben kann, was zu ungenauen Absorptionswerten der Probe führt.
OD600
Das Labor bestimmt die Wachstumsdichte der Bakterien und ihre Lebensdauer*, und schließt die Wachstumsdichte der Bakterien auf der Grundlage von Erfahrung und Sicht ab. Bei anspruchsvollen Experimenten muss ein Spektrophotometer verwendet werden, um die Dichte der Bakterienzellen genau zu bestimmen. OD600 ist die Standardmethode zur Verfolgung des mikrobiellen Wachstums in flüssigen Kulturen. Nehmen Sie die nicht zugesetzte Bakterienkultur als leere Flüssigkeit und quantitativ kultivierte Bakterienkultur. Um den richtigen Betrieb zu gewährleisten, muss eine Korrekturkurve für jedes Mikroorganisme und jedes Gerät mit einem Mikroskop durchgeführt werden. Der OD-Wert des Bakteriums erscheint gelegentlich im Experiment negativ, weil ein farbiges Kulturmedium verwendet wurde, d. h. Bakterienkultur nach einer Weile reagiert mit dem Kulturmedium und eine Verfärbungsreaktion auftritt. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die getesteten Proben nicht zentrifiziert werden können und Bakterien in Suspension bleiben.