Die Schulsaison ist wieder da.Experiment WangWieder mal "Ziegeln ziehen".
wieVorteilZiegeln von YaAuchKeine Hilfe.Bruder, Schwester

Natürlich.Aufmerksamkeit"Kleine Klasse"SpaltenJa.

Heute stellen wir euch die Kleine vor.
Es ist eineTrockenlast vollder
Praxishandbuch zur Phagen-Demonstration-Methode
"Vergrößerung und Quantifizierung von Bakteriophagen"

Das ist eine seltene Notiz.
Bitte sammeln!

Teil 1

Hybridtumore、Einzelliges KlonenundPhage-DemonstrationstechnikEs handelt sich um drei Haupttechnologien zur Entdeckung von Antikörpern, diePhage-DemonstrationstechnikAlsTechnologie auf NobelpreisstufeSie spielen eine wichtige Rolle bei der Forschung und Entwicklung von Bioinnovationen.* beschleunigt den Prozess der Entwicklung von Antikörpern.Phage-DemonstrationstechnikSie spielen nicht nur eine zentrale Rolle bei der Entdeckung und Optimierung neuer Antikörper und Peptide, sondern können auch in Kombination mit herkömmlichen Tierimmuntechnologien effektiv mit Nanoantikörpern und einer Plattform für die Entdeckung von genetisch veränderten Mäusen kombiniert werden.Vielfältiger Einsatz in Bereichen wie Antikörper, Antikörper-gekoppelte Medikamente und CAR-T/TCR-T.Dieser Artikel wird auf Phagen-Präsentation-Technologie Phagen-Vermehrung und Amplifikation Experiment Details zu erforschen, die Erfahrungen des spezifischen Experiments zu teilen, mit seinem Prinzip als Grundlage, um den Experimentsprozess zu lenken, um den Experimentsprozess zu verbessern und die Erfolgsquote der Phagen-Präsentation-Technologie im Antikörper-Entdeckungsprozess zu erhöhen.

Teil 2

- Bakteriophagenbibliothek
Grundprinzipien der Erweiterung und Darstellung.

Das heute weit verbreitete System von Phagen, das Antikörper-Fragmente zeigt, nennt sich„3+3-System“(3 ist das p3-Schalenprotein des Phagen)；3+3Es gibt zwei Quellen des p3-Proteins:

• Bakteriophagen (Phagemide)
• M13KO7 (Helper Phage)

BakterienDas p3-Protein auf (phagemid) fusiert die Gene der Antikörper-Fragmente und ist der Schlüssel zur Bibliotheksvielfalt;HilfsfagenDas p3-Protein auf der Helper Phage ist ein natürliches p3-Protein in den Phagen.
* Phagen sind ein relativ kleiner Plasmidträger, der eine hohe Transformationseffizienz im E. coli-Empfindungszustand hat und sich in der Lage ist, sich in E. coli zu vermehren.

Nachdem ein E. coli-Phage mit einer Helper-Phage infiziert wurde, wird das Enzymsystem, die Rohstoffe und die Energie von E. coli verwendet, um sich zu vergrößern, und schließlich wird ein E. coli-Phage mit Phagen freigegeben, der ein Antikörperschnitt des p3-Schalenproteins des Subphages zeigt.

Teil 3

Bei der Ausdehnung der Bakterien
Probleme und entsprechende Lösungen.

Der Prozess des Bankaufbaus von Phagen ist eigentlich ein Prozess der Übertragung der genetischen Vielfalt von Antikörper-Fragmenten:
Der Prozess der Übertragung der Vielfalt der Antikörper-Gene in Blutproben auf die Phagen ist der Inhalt der Phagen-Bibliothek aufgebaut;
Die Übertragung von der Vielfalt der Phagen auf die Vielfalt der E. coli, die Phagen enthalten, ist der Inhalt der Phagen-Plasmoden zur E. coli;
Die Übertragung von der Vielfalt von E. coli, die Phagen enthält, auf die Vielfalt von Phagen ist ein Inhalt der Phagenvergrößerung und ein Problem der experimentellen Erfahrung in diesem Artikel.

Das Ziel der Phage-Amplifikation ist es, eine einzige Kopie des Antikörper-Fragments-Gens in den Phagen durch den Phage-Amplifikationsprozess in 10-100 Kopien zu verwandeln.Und diese Kopien von Genen können Antikörper-Protein-Fragmente auf der Oberfläche der Phagen zeigen.

Um die Vielfalt der Bibliothek während des Phagenproliferationsprozesses aufrechtzuerhalten und weiterzugeben, müssen die Zahl und das Volumen von E. coli, die Phagen enthalten, während des proliferationsprozesses basierend auf der ursprünglichen Größe der Bibliothek bestimmt werden, wie viele zusätzliche Phagen effektiv infiziert werden sollen, und wie viele Phagen enthalten, die nach der proliferation ausgewählt werden sollen, müssen eine Berechnungsbewertung durchgeführt werden.Das Amplifikationsvolumen, das Phagenbibliotheken unterschiedlicher Bibliotheksgrößen während des Amplifikationsprozesses benötigen, ist unterschiedlich.Ein ausgehärtetes experimentelles Schema könnte zu einem Verlust der Bibliotheksvielfalt führen.
Um diese Probleme zu klären, müssen Sie zunächst über folgende grundlegende Kenntnisse verfügen:

（ 👇 Folgendes steht ganz im Mittelpunkt!!! ）

1. Lesungen von TG1 E. coli bei OD600: 1OD repräsentiert eine Bakterienkonzentration von 1e9 Einheiten / ml.
2. Phagen / Hilfsfagen haben eine vergleichsweise gute Infektionseffizienz, wenn TG1 bei Logarität * ist, und TG1 bei Logarität * hat einen OD600-Wert von 0,4-0,8.
3. Die Wachstumsrate von TG1 in der Logarithmus-Generation ist 20 Minuten und erfordert eine genaue Beobachtung des Wachstums von TG1 und eine rechtzeitige Entfernung für Experimente.4. Das Verhältnis von Hilfspagen und TG1 MOI bei 20: 1 kann sicherstellen, dass alle TG1 infiziert werden.
5. Phagen, die Phagen enthalten, sind in der Lage, normale TG1 E. coli zu infizieren und die Phagen in TG1 zu hinterlassen und zu vergrößern, wenn TG1 vergrößert wird, ohne Phagen zu unterstützen.
6.Phagen und Plasmoden enthalten * Resistenz, und Hilfspagen enthalten * Resistenz.
7. Phagen, die Bakteriophagen enthalten, können durch Infektion mit normalen TG1 titriert werden, gradient verdünnte beschichtete Agalplatten * resistent.8.Phagen, die Phagen enthalten, zeigen im 3 + 3-Modus eine geringere Effizienz von p3-fusionierten Antikörper-Fragment-Proteinen, nur 5% -10%, bei der Auswahl sollte der Titer der hinzugefügten Phagen mehr als das 100-fache der Bibliotheksdiversität sein.
Eine weitere wichtigere Frage ist:Phagen als Virus verbreiten sich leicht als Aerosol in die Luft und verunreinigen die Umgebung des Labors und infizieren damit F-Faktor-positive E. coli.(Bitte Bio-Wang, riskieren Sie Ihr Leben Ziegeln zu bringen!)
inRelatierte Experimente mit PhagenEs muss in einem relativ geschlossenen Labor durchgeführt werden.Um eine Kontamination mit E. coli durch Phagen zu vermeiden,Vor allem bei der Kultivierung normaler TG1 E. coli. Die Deaktivierung der Phagen erfolgt in der Regel durch UV-Bestrahlung für mehr als eine halbe Stunde.
(Qualifizierter Biowang, ein emotionaler Virusmörder!)

Teil 4

- Ausdehnung der BakterienErhöhung und Quantifizierung
Teilen von spezifischen Experimenten.

Im Folgenden ist ein experimentelles Schema für die Vergrößerung einer Phagen-Bibliothek mit einer Bibliotheksgröße von 1E9.
* Wenn die Bibliothek zu groß oder zu klein ist, kann das Volumen entsprechend erhöht werden.

Tag 1
(Ein Tag mit Ziegeln)

1. Nehmen Sie 1 ml der TG1-Spezies mit Phagen (Bakterienzahl 1E10) und fügen Sie sie in eine 250 ml-Shakerflasche mit 100 ml 2xYT-GA-Medium hinzu,verwendenOhhaus Schaukelbett37 Grad 220rpm Schüttelbett bis OD600 ca. 0,5.2. Nehmen Sie 20 ml der Flüssigkeit mit OD600 von ca. 0,5 (Bakterienzahl 1E10), fügen Sie die Hilfspage M13 K07 mit pfu von 2E11 nach MOI von 20: 1 und schwingen 37 ° 220 rpm für eine halbe Stunde zu infizieren.3. Nehmen Sie nach der Infektion Flüssigkeit in 50 ml Zentrifuge verwendenOrhaus Zentrifuge 5816R3200g Zentrifugieren 10 MinutenEntfernen Sie das Medium, um die Hemmung der Glukose-Proteinexpression im Medium zu entfernen, die in den P3-Protein-Fusionen-Antikörper-Fragmente in den Phagen.4. Mit 2xYT-AK-Medium resuspendieren, das Medium auf 400 ml hinzufügen und über Nacht mit 1 L-Schüttelflasche bei 30 Grad und 220 Umdrehungen pro Minute schütteln.

Tag 2
(Ziegelkopf am nächsten Tag)

5.400 ml Flüssigkeit in große Zentrifugeflaschen teilen,verwendenOrhaus Zentrifuge 5816R 10.000 g Zentrifugieren 10 MinutenEntfernen, 10,000 g wieder für 10 Minuten zentrifugieren,Entfernen Sie die übrigen Bakterienbrücke.6. Nehmen Sie 90 ml PEG-Lösung und fügen Sie sie zu 400 ml Oberflüssigkeit hinzu, inkubieren Sie sie für 1 Stunde bei 4 ° C und begleiten sie durch eine sanfte Oszillation undVerwenden Sie die Funktion der TieftemperatursteuerungOrhaus Zentrifuge 5816R 4 ℃ 10000g Zentrifuge 1 Stunde.7. Nach der Reinigung mit 10 ml PBS resuspensieren Sie die Bakterien und fügen Sie 2,5 ml PEG-Lösung wieder zur Fällung hinzu.8. 20 Minuten auf Eis inkubieren und dannVerwenden Sie die Funktion der TieftemperatursteuerungOrhaus Zentrifuge 5816R4 ℃ 10000g Zentrifuge für eine halbe Stunde.9. Entfernen Sie die reine Flüssigkeit, saugen Sie die restlichen PEG-Lösung mit Absorptionspapier, fügen Sie 1-2 ml PBS schwere Phage, um die Titration zu bestimmen.

Titermessung:
1. In einem getrennten Labor, nehmen Sie den normalen TG1 E. coli in das Medium von 2xYT hinzugefügt,verwendenOhhaus SchaukelbettSchüttelwert bis OD600 0,5Wenn es nicht rechtzeitig verwendet wird, kann es bei 4 ° C für 2 Stunden zum Ersatz gelassen werden.
2.Vergrößern Sie die Phage-Protoflüssigkeit in Schritt 9 und verdünnen Sie 1E5-1E7 mal mit PBS.
3. Nehmen Sie 10 ul Phage-Verdünnung zu 490 ul OD600 von 0,5 TG1 E. coli,verwendenOhhaus Schaukelbett 37 ° C 220 rpm Schwingung für eine halbe StundeInfektionen durchzuführen.
4. Nehmen Sie die Infektionsflüssigkeit 50ul gleichmäßig auf eine Agalplatte mit 2xYT-GA auftragen und nach Trocknung über Nacht in eine 37 ° C-Kulturkammer geben. Nicht infizierte TG1 E. coli wurden Agalplatten als negative Kontrolle aufgetragen.

Tag 3
(Der dritte Tag des Ziegels)

5. Anzahl der Klone in der Agalplatte von 2xYT-GA, berechnet auf der Grundlage des Verdünnungs-Vielfaches die Titration des vergrößerten Phages
Phage Titer (pfu / ml) = (Anzahl der Klone * 10 * 50 / 10ul) * Verdünnungsvermöglichung
6.Die Phagen 1E11-1E12 werden für die Auswahl verwendet.

Reagenzformulierung:
2xYT-Kulturmedium:Hefeextrakt 10,0 g/L+Trypton 16,0 g/L+NaCl 5,0 g/L
2xYT-GA-Medium:2xYT-Medium + 100 μg / ml * + 1% (W / V) Glukose
2xYT-AK-Medium:2xYT-Medium + 100 μg/ml * + 50 μg/ml*
PEG溶液：20% (w/v) PEG 6000, 2,5 M NaCl

Teil 5
Geräte*:

(Wissenschaftliche Arbeiter sind nicht allein jeden Tag, weil es kleine O Begleitung gibt)

Phagen als Virus können sich leicht in Form von Aerosolen in die Luft verbreiten, um die Umgebung des Labors zu verschmutzen, was ein geschlossenes Labor erfordert, in dem alle Laborgeräte separat verwendet werden müssen.
AarhusThermostatische leichte Last Kultur SchüttelbettDer Drehzahlbereich von 100 bis 12 U/min ist volumenintensiv und leistungsstark, um Ihre Probe mit einer ausgezeichneten Schwingung zu versorgen:

Darüber hinaus wird es während des Phagen-Demonstration-Experiments unterschiedliche Volumen, unterschiedliche Drehzahlen und Zentrifugalschritte geben, die 4 ° C-Bedingungen erfordern, wennmitMehr
ZentrifugeErfüllung der Anforderungen der ExperimenteEs wird zu einer Leere der Anlagen der experimentellen Ausrüstung führen, was zu Verschwendung führt!！！

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