Letzte Olympische Klasse sprach mit allen.ELISA-Methodikentwicklung in der Praxis - Entwicklung quantitativer Methoden zum Bio-Makromolekularen-Test.
Ein weiteres wichtiges Thema wird in dieser Ausgabe mit Ihnen geteilt: ELISA-Methodikentwicklung in der Praxis - Entwicklung von Methoden zur Affinitätsmessung.

I. Vorwort

Die Methode zur Bestimmung der Affinität zwischen den Rezeptorliganden, d. h. der Konstante des Dislocation-Gleichgewichts, ist hauptsächlich:

1. Thermodynamische Messmethoden
2. Dynamische Messmethoden
3. Sättigungskonzentrationsmethode

Die dynamischen Messmethoden und die Sättigungskonzentrationsmethoden sind allgemein:Dynamische Messmethoden(wie Biacore)Es geht um teurere Instrumente,Die Messung der Sättigungskonzentration ist die allgemein verwendete Messmethode der überwiegenden Mehrheit der inländischen Biopharmazeutikenunternehmen.

ELISA für die Affinitätsbestimmung ist das Hauptmodell der Sättigungskonzentrationsmethode, die häufig zur Beurteilung der Aktivität des Proteinspiegels von Antigenen oder Antikörpern und zur Stabilitätsbewertung von Antikörpern verwendet wird.
ELISAs werden für die Affinitätsmessung in oft nicht kommerzialisierten Kits verwendet und erfordern die Entwicklung von Methoden durch Experimentatoren.

Aufgrund der mangelnden Bildung in Biotechnologie und der unzureichenden Akkumulation von neuen Medikamentenentwicklungsunternehmen in dieser Anwendung ist eine methodisch verifizierte ELISA-Affinitätsmethode für viele Praktiker eine schwierigere Angelegenheit, und es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Fehler wie neue Nummernübertragungsfehler oder Abweichungen auftreten.
Einer dieser Fehlverwendungen ist die Entwicklung von ELISA-Affinitätsmethoden unter quantitativen experimentellen Bedingungen.

Dieser Artikel beginnt mit den Grundprinzipien der Methode zur Bestimmung der AffinitätBeschreiben Sie die Grundprinzipien der Sättigungskonzentrationsmethode Affinitätsmessung, eine Übersicht über die Dosisbeziehung von Antigen-Antikörpern während der Entwicklung der ELISA-Methode und einige Fehler, die bei der Anwendung von ELISA für die Affinitätsmessung auftreten können, und geben Sie eine Einführung in die allgemeinen Affinitätsmessungsschema und die vorläufigen Methoden, die entwickelt wurden.

Grundbegriff der Affinität

Wir haben einige chemische Reaktionsfälle analysiert und erklärt, was Affinität heißt.

例子A
Wasserstoff und Sauerstoff erzeugen Wasser unter Entzündungsbedingungen.
Wenn die molare Konzentration von Wasserstoff in der Reaktionsumgebung zufällig doppelt so hoch ist wie die molare Konzentration von Sauerstoff, werden beide verbraucht und es gibt nur Wasser in der Reaktionsumgebung; Wenn die molare Konzentration von Wasserstoff größer als das Doppelte der molaren Konzentration von Sauerstoff ist, wird Sauerstoff verbraucht und es gibt nur Wasserstoff und Wasser in der Reaktionsumgebung; Wenn die molare Konzentration von Fruchtwasserstoff weniger als das Doppelte der molaren Konzentration von Sauerstoff ist, wird Wasserstoff verbraucht und es gibt nur Sauerstoff und Wasser in der Reaktionsumgebung.
Dies ist die Grundkenntnisse über chemische Reaktionen, die als Ergebnis einer chemischen Reaktion durchgeführt werden können, die Reaktion kann in ein Produkt verwandelt werden, d. h. die Reaktion kann bis zum Ende durchgeführt werden, und die Reaktion mit den Eigenschaften des Prozesses und des Ergebnises einer solchen Reaktion wird als irreversible Reaktion bezeichnet.

例子B
PD1 Antigenvon CD279)PD1 Antikörper(wie pvon Mbrolizumab)Reagiert bei Normaldruck.
Wenn die molare Konzentration von CD279 in der Reaktionsumgebung 200 nM beträgt und die molare Konzentration von Pembrolizumab 100 nM beträgt, beträgt die Konzentration des Pembrolizumab-CD279-Komplexes unter idealen Bedingungen 97,86 nM, die molare Konzentration von CD279 4,28 nM und Pembrolizumab 2,14 nM;
Wenn die molare Konzentration von CD279 in der Reaktionsumgebung 100 nM beträgt und die molare Konzentration von Pembrolizumab 200 nM beträgt, beträgt die Konzentration des Pembrolizumab-CD279-Komplexes unter idealen Bedingungen 49,81 nM, die molare Konzentration von CD279 0,38 nM und Pembrolizumab 159,19 nM.

Beispiel C
PD1 Antigenvon CD279)PDL1 Antigenvon CD274)Reagiert bei Normaldruck.
Wenn die molare Konzentration von CD279 in der Reaktionsumgebung 200 nM beträgt und die molare Konzentration von CD274 100 nM beträgt, beträgt die Konzentration des CD274-CD279-Komplexes unter idealen Bedingungen bei der Reaktion 2,35 nM, die molare Konzentration von CD279 197,65 nM und die molare Konzentration von CD274 97,65 nM;
Wenn die molare Konzentration von CD279 in der Reaktionsumgebung 100 nM und die molare Konzentration von CD274 200 nM beträgt, beträgt die Konzentration des CD274-CD279-Komplexes unter idealen Bedingungen 2,35 nM, die molare Konzentration von CD279 97,65 nM und die molare Konzentration von CD274 197,65 nM, wobei die überwiegende Mehrheit von CD279 und CD274 nicht an der Reaktion beteiligt sind.
Fälle B und C, sowohl Antigen als auch Antikörper(Liganden und Rezeptoren)Die Kombinationsreaktion, beide Reaktionen haben einen positiven Prozess der Erzeugung von Komplexen, es gibt auch einen Prozess der Komplexlösungsreaktion zur Erzeugung von Antigenen und Antikörper-Reverse-Reaktionen, das letzte Ergebnis ist der Zustand der Koexistenz von Antigenen, Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen.

Diese Reaktion nennt manReversible Reaktion.
Wenn die Geschwindigkeit der positiven und inversen Reaktion in einer reversiblen Reaktion gleich ist, erhöhen oder verringern sich die Konzentrationen von Antigenen, Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen im Reaktionssystem nicht mehr, und die reversible Reaktion ist abgeschlossen, und die molaren Konzentrationen der einzelnen Komponenten im Reaktionssystem befinden sich im dynamischen Gleichgewicht.

Affinität(Affinität)Ist der charakteristische Parameter des relativen Zustands zwischen Antigen, Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen während einer reversiblen Reaktion, dessen spezialisierter und terminologischer Name ist die Desogengleichgewichtskonstante KD, Einheit mol / L(entsprechend Konzentrationseinheiten).

Je kleiner der Affinitätswert ist, desto stärker ist die Affinität, und die Stärke der Affinität bestimmt, wie viel die relativen Komponenten der reversiblen Reaktion zum Abschluss der Reaktion sind.

Wie in den Beispielen B und C ist das gleiche mit 200 nM CD279(PD1)Reaktionen auf Antikörper Pembrolizumab(PD1 Antikörper)Affinität gegenüber CD279 0,4 nM, Ligand CD274(PDL1)Mit einer Affinität von 8200 nM gegenüber CD279 betrug der durch die endgültige Reaktion erzeugte Pembrolizumab-CD279-Komplex 97,86 nM, während der CD274-CD279-Komplex nur 2,35 nM betrug.

Im Gegensatz zu irreversiblen Reaktionen, zusätzlich zu den molaren Konzentrationen von Antigen-Antikörpern, Antigen und Antikörper(Liganden und Rezeptoren)Die Affinität zwischen den beiden wird * beeinflussen, wie viel der Erzeugnisse in der reversiblen Reaktion.

Kennen Sie die Grundprinzipien der ELISA-Methodik?

Für einen Überblick über die Methoden und Prinzipien der Affinitätsbestimmung können sich die Leser auf die Affinitätsbewertung von Biofunktionelle Screening-Bewertungstechniken beziehen.
Dieser Artikel umfasst hauptsächlich die Sättigungskonzentrationsmethode.
RVertreterEmpfängeroderAntigen，LVertreterLigandenoderAntikörper.
Mit der Sättigungskonzentrationsmethode, wenn die Affinität des Ligands gegenüber dem Rezeptor bestimmt werden soll, wird L gradient verdünnt, um die Konzentration des R-L-Komplexes zu erkennen, wenn die Konzentration des R-L-Komplexes die Hälfte der Gesamtkonzentration von R ausmacht, L entspricht dem Konzentrationswert(EC50)Das ist der KD-Wert von L relativ zu R.
Der RL-Komplex/R, d.h. der B-Wert, kann anstelle des nachweisbaren Signalwertes verwendet werden, und die funktionelle Beziehung zwischen dem gradientenverdünnten L und dem Signal erfüllt die folgende Formel, nur wenn der EC50-Wert unter bestimmten experimentellen Bedingungen dem KD-Wert entspricht.
Es gibt mehrere Schlüsselpunkte zur Messung des KD-Wertes durch die Sättigungskonzentrationsmethode,Das heißt, die Wechselwirkung der beiden Moleküle, R ist eine kleine Menge, L ist eine kontinuierliche Gradientenverdünnung durchzuführen, muss der Signalreaktionswert erhalten werden(Alle Verbindungsstellen von R werden von L besetzt)Das heißt, die Plattform-Periode, dann unter diesen Bedingungen, wenn die Hälfte R besetzt, die erforderliche L-Konzentration(EC50)Der KD-Wert.
Die Sättigungskonzentrationsmethode bestimmt hauptsächlich den Signalwert, der den RL-Komplex repräsentiert, und die Methode kann Flow-Zytologie, Isotopmarkierung, Fluoreszenzpolarisierung oder ELISA sein.

ELISA-Methodikentwicklung für die Affinitätsmessung

Layout

Allgemeiner Betriebsprozess

01Zubereitung der Enzym-Markierungsplatte: Nehmen Sie die Konzentration von 100 µg / ml Antigen, lösen Sie bei Raumtemperatur, mischen Sie mit der Packung mit der Flüssigkeit nach den folgenden Schritten auf 0,2 µg / ml, 0,5 µg / ml, 1 µg / ml verdünnen, fügen Sie 100 µl / Loch nach der Probenanlage hinzu und fügen Sie die Enzym-Markierungsplatte zu.(Anmerkung 1), in dem die Packung von Flüssigkeit zur Kontrolle der Packung von Antikörpern hinzugefügt wird, 2-8 ° C über Nacht;
02Waschen Sie die Platte 3mal mit Waschflüssigkeit, trocknen Sie und fügen Sie 300ul / Loch-Schließflüssigkeit hinzu(Anmerkung 2)Raumtemperatur geschlossen 1 Stunde; Waschflüssigkeit, die Platte 3 mal zu waschen und zu trocknen;
03Entsprechend dem Layout verdünnen Sie den Antikörper in einem Gradienten von 100.000 ng/ml(Hinweis 3)Entsprechend dem Layout werden 100ul / Loch in die Mikroporplatte hinzugefügt;
04EinfügenOhhaus Mikroporen Oszillator (ISLDMPHDG)Innerhalb der Einstellung 37 ° C, 600 rpm Oszillation für 1 Stunde;

053 mal mit Waschflüssigkeit waschen und trocknen;
06Enzymbindende Antikörper verdünnen auf die richtige Konzentration(Hinweis 4)InDer Orhaus-Turbine(VXMNFS)aufMischen, 100ul / Loch;

07In den Mikroporen-Platen-Oszillator setzen, 37 ° C, 600 rpm Oszillation für 1 Stunde einstellen;
084 mal mit Waschflüssigkeit waschen und trocknen;
09Nehmen Sie die entsprechende farbige Flüssigkeit des enzymatischen Antikörpers, nehmen Sie 20 Minuten vor der Anwendung das Gleichgewicht auf Raumtemperatur und mischen Sie es auf einem Wirbelmischer;
10Verwenden Sie 8 Abwehrpistolen mit 100 µl/Loch zur Farbgebung;
11Lichtschutz bei Raumtemperatur 10-30 Minuten(Hinweis 5)；
12Verwenden Sie 8 Abwehrpistolen, um die Reaktion mit 100 µl / Loch zu beenden(Je nach Substrat ist dieser Schritt möglicherweise nicht erforderlich)；
13Messung des Signalwertes mit einem Enzym-Calibrator(Hinweis 6)；
14Ergebnisanalyse(Hinweis 7).

Kleine Note

Anmerkung 1:Bei Bedarf reduzieren Sie hohe Konzentrationen von Antikörpern während der Reaktion(100.000ng/ml)Nichtspezifische Adsorption von Enzym-Markierungsplatten, während des Verpackungsprozesses wird empfohlen, hydrophobe Enzym-Markierungsplatten zu wählen(Polysorp)Die Antigenkonzentration der Verpackung erfordert eine kleine Menge von 0,2-1 µg / ml, die spezifische Situation muss auf der Grundlage der Affinitätsgröße des Antigenantikörpers beurteilt werden. Im Allgemeinen ist je stärker die Affinität, desto niedriger ist die erforderliche Antigenpackung konzentriert.
Anmerkung 2:Schließflüssigkeit kann nicht unbedingt einen Schließeffekt spielen, erfordert eine experimentelle Validierung(Nicht verpackte Antigene)Im Allgemeinen ist je kleiner das Molekulargewicht, desto besser die Verschlusswirkung.
Anmerkung 3:In der frühen Phase der Methodenentwicklung kann der Konzentrationsbereich der Standardkurve von 100.000 ng/ml bis 0,1 ng/ml vergrößert werden, um eine vollständige Kurve mit einer offensichtlichen Plattformperiode zu erhalten, wenn die Antigen-Antikörper-Affinität stark ist, kann die Gradientenkonzentration reduziert werden, und das Verdünnungsvermögen kann während der Methodenoptimierung auf das Doppelte reduziert werden.
Anmerkung 4:Der Enzym-Antikörper-Effekt ist überdosiert, die Verdünnung des Enzym-Antikörpers muss verschiedene Verdünnungsgrade für die vergleichende Auswahl machen, für die Enzym-Antikörper-Komponente von Monomab, wenn die beiden Verdünnungsgrade des Enzym-Antikörpers die gleiche Dosierungskurve erzeugen können, zeigt, dass die Enzym-Antikörper-Überdosierung, die Signalisierung von ELISA keine Abweichung hat.
Für polyantibodische enzymbundene Antikörper ist die Beurteilung ihrer Verdünnung komplexer, und die molare Konzentration des enzymbundenen Antikörpers kann zunächst mehr als das 5-fache der molaren Konzentration des Antigens auf der Abdeckung berechnet werden. Wenn die Konzentration von enzymbundenen Antikörpern geringer ist, werden enzymbundene Antikörper unter Bedingungen mit hohen Dosen von unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörpern gefangen und die Kurve ist falsch auf der Plattform.
Anmerkung 5:Für Substrate mit Absorptionswerten und Fluoreszenzsubstrate ist der Signalwert des Instruments im direkten Verhältnis zu der Anzeigezeit und die Steuerung in 10-30 Minuten geeignet. Es ist notwendig, den linearen Bereich des Signals des Detektionsinstruments im Voraus zu bestätigen, zum Beispiel der allgemeine Enzym-Marker-Absorptionswert des Signals im linearen Bereich von 0-3, der Absorptionswert zwischen 3-4 ist nicht linear, bei der Anzeige der Farbe sollte der Signalwert nicht mehr als 3 kontrolliert werden, wenn der Signalwert den linearen Bereich überschreitet, hat die Kurve eine falsche Plattform.
Anmerkung 6:Unterschiedliche Substrate müssen mit verschiedenen Instrumenten getestet werden, Absorptionswerte, Fluoreszenzverteile und chemische Leuchtmittellesewerte. Beachten Sie bei der Substratauswahl, ob das Enzym-Calibrator im Labor eine solche Art von Lesefunktion hat.
Anmerkung 7:Standard-Dosierungskurven sind in der Regel mit vier Parametern angepasst und erfordern eine offensichtliche Plattformperiode(Werte A und D)Die Steigung liegt in der Regel zwischen 0,8 und 1,2.(B-Wert)Zwischen, EC50（C-Wert)Das ist der Wert der Affinität des Antikörpers gegenüber dem Antigen.

V. Zusammenfassung

Nach der Sättigungskonzentrationsmethode ist eine offensichtliche S-Kurve mit vier Parametern erforderlich, d. h. eine Signalkurve, die sich mit der Antikörperkonzentration schrittweise ändert.
Bei niedrigen und hohen Konzentrationen von Antikörpern gibt es eine deutliche Plattform-Upside-Down-Periode, die der Hälfte des Signalwertes der Upside-Periode entspricht(EC50)Der Wert ist der KD-Wert der Antigen-Antikörper-Affinität.
Da der lineare Bereich der Messsignale des Instruments begrenzt ist, wird die gemessene Affinität ungenau sein, wenn das Signal den linearen Bereich überschreitet.
Die Antigenkonzentration des Pakets bestimmt direkt den Signalwert des Signals,Daher ist bei der Affinitätsmessung mit ELISA die Antigenkonzentration so klein wie möglich, um einen geeigneten Signalwert zu erhalten; Auch eine zu niedrige Konzentration von enzymbundenen Antikörpern kann die Kurve in eine falsche Plattformphase bringen.

Bei der Entwicklung der ELISA-Methodik muss die lineare Übertragung von Enzymbindungs-Antikörpern als Signal experimentell verifiziert werden.
Wenn das Signal nicht effektiv auf der Plattform-Periode erhalten kann, ist die Affinität zwischen Antigen-Antikörpern zu schwach oder zu viel Antigen verpackt und eine höhere Konzentration von Antikörpern erforderlich, um alle Antigene zu fangen, um die Plattform-Periode zu erreichen.
Beschränkt durch ELISA-Empfindlichkeit, in einigen Fällen schwacher Affinität(>100 nM)Bei Antikörpern, die mit der ELISA-Methode im Wesentlichen keine effektive Plattform-Periode oder messbare Affinitätswerte zu erhalten.
Bei einer ELISA-Affinitätsmessung zur Bewertung der Antigen-Aktivität oder zur Bestimmung der Antikörper-Aktivität wird der EC50 nicht so klein wie möglich erhalten, dass das Signal in die falsche Plattform-Phase eintritt.(Erreichung der Messgrenzen des Instruments, geringere Enzymbindungskonzentration)Die EC50 wird kleiner, wodurch falsche Affinitätsdaten erhalten werden, was bei der Affinitätsmessung durch ELISA leicht auftreten kann.
Viele Anbieter von Antigenen haben heute solche Fehler in der Bewertung der Antigenaktivität.

Die Affinität zwischen Antigen und Antikörpern wird durch die Struktur und die Wechselwirkung beider bestimmt.Es kann 0,1 nM, 1 nM oder 1000 nM sein. Für die Bewertung des Wohls oder Schlechtes der ELISA-Affinitätsmethode muss festgestellt werden, ob dieser EC50-Wert mit dem Wert der Affinität übereinstimmt, der durch Thermodynamik, Dynamik und Zellstrommessungen in Sättigungskonzentrationen mehrfach verifiziert werden kann.
Umgekehrt, wenn eine ELISA-Methode nicht vorhanden ist, wie ein Signal in eine gefälschte Plattform Periode(Erreichung der Messgrenzen des Instruments, geringere Enzymbindungskonzentration)Wenn ein Fehler entsteht, kann der EC50-Wert nur den wahren Wert der Affinität widerspiegeln.

Die Methoden mit ELISA für die Entwicklung erfordern eine klare Anwendungszwecke, Massomolekulare Quantifizierung und Affinitätsmessung.
Verschiedene Anwendungszwecke, die relative Dosis-Konzentration von Antigen und Antikörpern wird sehr unterschiedlich sein, es gibt verschiedene Dosis-Kurven,Der Leser kann die Unterschiede in Verbindung mit der vorherigen Studie „ELISA Methodologie Entwicklung Praxis Edition - Entwicklung quantitativer Methoden für Bio-Makromolekular-Tests“ erkennen.

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